Исследование проведено на базе факультета биотехнологий и рыбного хозяйства МГУТУ им. К.Г.Разумовского. Руководитель НИР, вед. науч. сотр., канд. биол. наук Никифоров-Никишин Д.Л.
В статье представлены результаты по исследованию двух комплексных пищевых добавок «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» (далее «Микробиотики МИКСТ») и «Микробиоша микст» в составе кормов на Данио рерио (Danio rerio) в двух концентрациях (2,5 и 5% от массы корма). Для опыта были сформированы 5 опытных групп рыб, включавших: контроль, получающий стандартный корм без добавок; опытная группа с 2,5 и 5% внесения пищевой добавки «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» (Mixt2,5 и Mixt5) и опытные групп с 2,5 и 5% внесения пищевой добавки «Микробиоша микст» (Mbio2,5 и Mbio5). В ходе исследования производилась оценка размерно-весовых, гематологических показателей (относительное количество клеток лейкоцитарного ряда и незрелых/ювенильных эритроцитов), возможной генотоксичности с использованием микроядерного теста эритроцитов периферической крови и изучение гистологических препаратов кишечника, печени и панкреаса.
По результатам работы было установлено, что пищевая добавка «Микробиотики МИКСТ» в концентрации 5% от массы корма привела к незначительному увеличению относительного прироста массы по сравнению с контролем. Комплексная пищевая добавка «Микробиоша микст» в концентрации 2,5 и 5% на 15 и 30 дни эксперимента приводила к достоверному увеличению встречаемости незрелых форм эритроцитов рыб. Обе исследуемые пищевые добавки вызвали изменения относительной встречаемости бластовых форм клеток крови. Для пищевой добавки «Микробиоша микст» отмечен выраженный иммуностимулирующий эффект, выражающийся в увеличении количества клеток лейкоцитарного ряда в слизистой кишечника и стимуляции секреторной активности. Физиологических, гематологических и гистологических нарушений у рыб в опытных группах по окончании эксперимента выявлено не было.
Данио рерио (Danio rerio) является распространенным тест-объектом, повсеместно используемым в лабораторных исследованиях в области медицины, физиологии и токсикологии (Vliegenthart et al., 2014; Martínez-Sales et al., 2015; Cassar et al., 2019). Схожесть многих физиологических процессов с человеком, а также простота содержания и разведения, позволяет проводить комплексные исследования как фармакологических субстанций, компонентов кормов, продуктов питания, так и пищевых добавок (Смородинская, 2022; Kochetkov et al., 2022). Среди наиболее чувствительных тест-параметров можно выделить гематологические и гистологические показатели, что позволяет в короткие сроки оценить влияние исследуемого компонента на отдельные физиологические параметры рыбы (Torres et al., 2014)
Результаты исследования
Можно предположить, что входящие в состав пищевых добавок пробиотические штаммы и/или биологически активные компоненты привели к увеличению адсорбции питательных веществ в кишечнике, что оказало влияние на интенсивность метаболической активности печени и других органов. Изменения в метаболизме в результате перехода к более эффективным кормам может приводить к увеличению активности кроветворения и выходу незрелых эритроцитов из мест депонирования (Chen et al., 2017).
Исследования по оценке влияния двух комплексных пищевых добавок («Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» и «Микробиоша микст») на ряд тест-показателей Danio rerio продемонстрировали наличие влияния исследуемых продуктов на ряд цитологических и гистологических показателей рыб.
Мониторинг гидрохимических показателей водной среды аквариумов содержания контрольных и опытных групп рыб за все время эксперимента обнаружил отсутствие превышения нормативных показателей. Температура, концентрация растворенного кислорода и водородный показатель практически не изменялись за все время эксперимента. Метаболиты азотистого ряда не достигали токсичных концентраций и снижались при периодической замене воды. Максимальная концентрация аммонийного азота за все время опытов составила 0,07 мг/л, нитритного азота - 0,21 мг/л и нитратного азота - 20 мг/л. Такие концентрации не могли повлиять на ход эксперимента, так как значительно не отличались во всех емкостях для содержания рыб.
Молодые особи Danio rerio за время опыта продемонстрировали высокую динамику роста. Средний относительный прирост массы составлял не менее 50%. Наибольшая разница в приросте относительно начала опыта отмечалась в группе Mixt5 и составила 151,2 мг или 59,3%, достоверно не отличаясь от контроля. Все экспериментальные особи отличались высокой упитанностью и нормальным кормовым поведением.
Исследования периферической крови и органов кроветворения Danio rerio позволили установить, что при кормлении комплексными пищевыми добавками на 15 и 30 сутки опыта отмечена достоверная разница во встречаемости незрелых эритроцитов в периферической крови. Так, в группе Mbio5 относительное количество незрелых эритроцитов составило 0,73% на 15 и 0,71% на 30 сутки, достоверно превышая показатели контрольной группы. При этом, в группе Mixt5 достоверное отличие от контроля по встречаемости данного клеточного элемента было зафиксировано только на 30 сутки. Это указывает на то, что исследуемые комплексные пищевые добавки оказывают достоверное влияние на активность эритропоэза и/или выход молодых эритроцитов из мест депонирования. Количество белых клеток крови в течение опыта значительно не отличалось во всех опытных группах.
Так как основным органом кроветворения у Danio rerio выступает головная часть туловищной почки, исследования мазков данной части органа позволяют изучить влияние исследуемых пищевых добавок на изменение соотношения незрелых форменных элементов крови. Так, в группах Mbio было выявлено достоверное увеличение встречаемости ортохромных эритробластов по сравнению с контролем на 33,3 и 19,3%, соответственно. При этом, относительная встречаемость зрелых эритроцитов существенно не изменялась во всех экспериментальных группах. Помимо этого, в группе Mixt5 отмечалось достоверное увеличение встречаемости сегментоядерных форм гранулоцитов. Исходя из полученных данных, можно утверждать, что исследуемые комплексные пищевые добавки достоверно влияют на активность эритропоэза.
Исследуемые комплексные пищевые добавки не оказывали достоверного влияния на встречаемость эритроцитов с ядерными нарушениями в периферической крови Danio rerio и не обладают генотоксическим эффектом. Помимо этого, было установлено, что группа Mixt5 имела достоверно меньшее значение общего числа ядерных нарушений.
Органом Danio rerio, проявившим наибольшую чувствительность к применению в кормах комплексных пищевых добавок, являлся кишечник. В кишечнике опытных групп отмечалось повышение количества интраэпителиальных лейкоцитов и эозинофильных гранулоцитов в слизистой, а также увеличение количества и площади бокаловидных клеток. Данные изменения, вероятнее всего, напрямую связаны с действием пробиотических штаммов, входящих в состав препарата, и указывают на модуляцию естественного иммунного ответа и барьерной функции кишечника. Наибольший положительный эффект на ткани кишечника оказала комплексная пищевая добавка Mbio.
Было установлено, что комплексная пищевая добавка «Микробиоша микст» в обоих исследуемых концентрациях приводит к увеличению секреции зимогенных гранул на протяжении всего опыта. Это подтверждается измерениями количества гранул в ациноцитах, которые достоверно превышали контрольные значения на 43,5 и 59,6% (на 15 и 30 сутки соответственно). Добавка «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» не оказала достоверного воздействия на экзосекреторную функцию поджелудочной железы.
В печени, почках и жабрах опытных рыб существенных отклонений от контроля обнаружено не было.
Выводы
1. В условиях эксперимента продолжительностью 30 суток комплексная пищевая добавка «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» в концентрации 5% от массы корма привела к незначительному увеличению относительного прироста на 6,11% по сравнению с контролем;
2. Комплексная пищевая добавка «Микробиоша микст» на 15 и 30 сутки в концентрации 2,5 и 5% приводила к достоверному увеличению встречаемости незрелых форм эритроцитов, что указывает на ускорение эритропоэза;
3. Обе исследуемые пищевые добавки вызывали изменение относительной встречаемости бластовых форм клеток крови. Пищевая добавка «Микробиоша микст» приводила к увеличению количества ортохромных эритробластов на 33,3 и 19,3% относительно контроля, а пищевая добавка «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» вызывала увеличение встречаемости сегментоядерных гранулоцитов на 20%. Это подтверждает влияние пищевых добавок на активность эритропоэза;
4. Микроядерный тест показал отсутствие генотоксического эффекта исследуемых концентраций двух комплексных пищевых добавок. Группа Mixt5 имела достоверно меньшую частоту встречаемости общего числа ядерных нарушений, что может указывать на антиоксидантную активность пищевой добавки;
5. Для пищевой добавки «Микробиоша микст» отмечен выраженный иммуностимулирующий эффект, выражающийся в увеличении клеток лейкоцитарного ряда в слизистой кишечника и стимуляции секреторной активности. Возможно, максимальная концентрация пищевой добавки «Микробиотики МИКСТ с экстрактом косточки абрикоса» вызывает незначительную вакуолизацию печени, что не может быть отнесено к патологическим нарушениям, а является частью адаптационной реакции, выраженной в накоплении дополнительных питательных веществ.
Установлено, что комплексная пищевая добавка «Микробиоша микст» приводит к увеличению секреторной активности гепатопанкреаса Danio rerio. Воздействия комплексных пищевых добавок на структуру почечной ткани и жаберного аппарата рыб выявлено не было.
6. Обобщая полученные данные, следует обратить внимание, что исследуемые комплексные пищевые добавки в указанных концентрациях (2,5 и 5% от массы корма или численности пробиотических организмов 2,5*105 и 5*105 КОЕ/г корма) оказывают влияние на состояние тест-показателей органа кроветворения и желудочно-кишечного тракта модельного объекта Danio rerio, проявляя свои иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства.
Список литературы
1. Головина Н. А. Морфофункциональная характеристика крови рыб-объектов аквакультуры. – 1996.
2. Иванова Н. Т. Атлас клеток крови рыб: сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб. – Легкая и пищевая промышленность, 1983.
3. Смородинская, С. В. Разработка метода оценки биобезопасности пищевых добавок методом микроядерного теста на эритроцитах Danio rerio / С. В. Смородинская // Товаровед продовольственных товаров. – 2022. – № 6. – С. 404-412. – DOI 10.33920/igt-01-2206-05.
4. Текебаева Ж. Б. и др. Пробиотики и их применение в аквакультуре //Новости науки Казахстана. – 2020. – №. 4. – С. 170-185.
5. Ahmed I., Ahmad I. Effect of dietary protein levels on growth performance, hematological profile and biochemical composition of fingerlings rainbow trout, Oncorhynchus mykiss reared in Indian himalayan region //Aquaculture Reports. – 2020. – Т. 16. – С. 100268.
6. Bagdonas E., Vosylienė M. Z. A study of toxicity and genotoxicity of copper, zinc and their mixture to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Biologija. – 2006. – Т. 52. – №. 1.
7. Barba‐Escobedo P. A., Gould G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects //Genes, Brain and Behavior. – 2012. – Т. 11. – №. 3. – С. 366-373.
8. Bolognesi C., Hayashi M. Micronucleus assay in aquatic animals //Mutagenesis. – 2011. – Т. 26. – №. 1. – С. 205-213.
9. Burgos-Aceves M. A., Campos-Ramos R., Guerrero-Tortolero D. A. Description of peripheral blood cells and differential blood analysis of captive female and male leopard grouper Mycteroperca rosacea as an approach for diagnosing diseases //Fish physiology and biochemistry. – 2010. – Т. 36. – С. 1263-1269.
10.Canedo A. et al. Micronucleus test and nuclear abnormality assay in zebrafish (Danio rerio): Past, present, and future trends //Environmental Pollution. – 2021. – Т. 290. – С. 118019.
11.Cassar S. et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology //Chemical research in toxicology. – 2019. – Т. 33. – №. 1. – С. 95-118.
12.Chen Y. H. et al. Zinc as a signal to stimulate red blood cell formation in fish //International Journal of Molecular Sciences. – 2017. – Т. 18. – №. 1. – С. 138.
13.Clauss T. M., Dove A. D. M., Arnold J. E. Hematologic disorders of fish //Veterinary clinics of North America: Exotic animal practice. – 2008. – Т. 11. – №. 3. – С. 445-462.
14.da Cunha R. L. D., de Brito-Gitirana L. Effects of titanium dioxide nanoparticles on the intestine, liver, and kidney of Danio rerio //Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2020. – Т. 203. – С. 111032.
15.De Souza Filho J. et al. Mutagenicity and genotoxicity in gill erythrocyte cells of Poecilia reticulata exposed to a glyphosate formulation //Bulletin of environmental contamination and toxicology. – 2013. – Т. 91. – С. 583-587.
16.Evdokimov E. G., Flerova E. A. Features of Erythropoiesis of the Mesonephros and Peripheral Blood in Polypterus senegalus (Polypteridae) //Journal of Ichthyology. – 2022. – Т. 62. – №. 7. – С. 1521-1527.
17.Fenech M. The in vitro micronucleus technique // Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. – 2000. – Т. 455. – №. 1-2. – С. 81-95.
18.Fijan N. Composition of main haematopoietic compartments in normal and bled channel catfish //Journal of Fish Biology. – 2002. – Т. 60. – №. 5. – С. 1142-1154.
19.Glomski C. A., Tamburlin J., Chainani M. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte. III. Fish, the lower vertebrate experience //Histology and histopathology. – 1992.
20.Gupta T., Mullins M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish //JoVE (Journal of Visualized Experiments). – 2010. – №. 37. – С. e1717.
21.Hoseini S. M. et al. Effects of dietary cineole administration on growth performance, hematological and biochemical parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) //Aquaculture. – 2018. – Т. 495. – С. 766-772.
22.Huang X. et al. Enteritis in hybrid sturgeon (Acipenser schrenckii♂× Acipenser baeri♀) caused by intestinal microbiota disorder //Aquaculture Reports. – 2020. – Т. 18. – С. 100456.
23.Katzenback B. A., Belosevic M. Isolation and functional characterization of neutrophil-like cells, from goldfish (Carassius auratus L.) kidney //Developmental & Comparative Immunology. – 2009. – Т. 33. – №. 4. – С. 601-611.
24.Kochetkov N. et al. Ability of Lactobacillus brevis 47f to Alleviate the Toxic Effects of Imidacloprid Low Concentration on the Histological Parameters and Cytokine Profile of Zebrafish (Danio rerio) //International Journal of Molecular Sciences. – 2023. – Т. 24. – №. 15. – С. 12290.
25.Kochetkov N. I. et al. Evaluating possible genotoxicity of three feed additives recommended for aquaculture by using micronucleus test on Danio rerio erythrocytes //Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия: Рыбное хозяйство. – 2022. – №. 3. – С. 48-59.
26.Kondera E. Haematopoiesis in the head kidney of common carp (Cyprinus carpio L.): a morphological study //Fish physiology and biochemistry. – 2011. – Т. 37. – С. 355-362.
27.Martínez-Sales M., García-Ximénez F., Espinós F. J. Zebrafish as a possible bioindicator of organic pollutants with effects on reproduction in drinking waters //Journal of Environmental Sciences. – 2015. – Т. 33. – С. 254-260.
28.Megarani D. V. et al. Comparative morphology and morphometry of blood cells in zebrafish (Danio rerio), common carp (Cyprinus carpio carpio), and tilapia (Oreochromis niloticus) //Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. – 2020. – Т. 59. – №. 6. – С. 673-680.
29.Mocanu E. E. et al. The Effect of Probiotics on Growth Performance, Haematological and Biochemical Profiles in Siberian Sturgeon (Acipenser baerii Brandt, 1869) //Fishes. – 2022. – Т. 7. – №. 5. – С. 239.
30.Murtha J. M., Qi W., Keller E. T. Hematologic and serum biochemical values for zebrafish (Danio rerio) //Comparative medicine. – 2003. – Т. 53. – №. 1. – С. 37-41.
31.Nikiforov-Nikishin A. et al. Effects of three feed additives on the culturable microbiota composition and histology of the anterior and posterior intestines of Zebrafish (Danio rerio) //Animals. – 2022. – Т. 12. – №. 18. – С. 2424.
32.Nikiforov‐Nikishin A. et al. The influence of probiotics of different microbiological composition on histology of the gastrointestinal tract of juvenile Oncorhynchus mykiss //Microscopy Research and Technique. – 2022. – Т. 85. – №. 2. – С. 538-547.
33.Nikinmaa M. Vertebrate red blood cells: adaptations of function to respiratory requirements. – Springer Science & Business Media, 2012. – Т. 28.
34.OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) (1997) OECD Guideline 473, In vitro mammalian chromosome aberration test, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris, France
35.R Core Team (2021). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/.
36.RStudio Team (2020). RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC, Boston, MA URL http://www.rstudio.com/
37.Sanchez L. M. et al. Examining the fish microbiome: vertebrate-derived bacteria as an environmental niche for the discovery of unique marine natural products //PloS one. – 2012. – Т. 7. – №. 5. – С. e35398.
38.Schindelin J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis //Nature methods. – 2012. – Т. 9. – №. 7. – С. 676-682.
39.Suvarna K. S., Layton C., Bancroft J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. – Elsevier health sciences, 2018.
40.Torres L. et al. Health status of Largescale Sucker (Catostomus macrocheilus) collected along an organic contaminant gradient in the lower Columbia River, Oregon and Washington, USA //Science of the total environment. – 2014. – Т. 484. – С. 353-364.
41.Van Doan H. et al. Host-associated probiotics: a key factor in sustainable aquaculture //Reviews in fisheries science & aquaculture. – 2020. – Т. 28. – №. 1. – С. 16-42.
42.Vliegenthart A. D. B. et al. Zebrafish as model organisms for studying drug‐induced liver injury //British journal of clinical pharmacology. – 2014. – Т. 78. – №. 6. – С. 1217-1227.
43.Wolf J. C. et al. Nonlesions, misdiagnoses, missed diagnoses, and other interpretive challenges in fish histopathology studies: a guide for investigators, authors, reviewers, and readers //Toxicologic pathology. – 2015. – Т. 43. – №. 3. – С. 297-325.
44.Wolf J. C., Wheeler J. R. A critical review of histopathological findings associated with endocrine and non-endocrine hepatic toxicity in fish models //Aquatic Toxicology. – 2018. – Т. 197. – С. 60-78.
45.Zhang C. et al. Effect of tributyltin on antioxidant ability and immune responses of zebrafish (Danio rerio) //Ecotoxicology and environmental safety. – 2017. – Т. 138. – С. 1-8.